組織RNA提取工作都需要在嚴格的無菌、無酶環境中進行,所用到的實驗耗材也需要進行無RNA酶處理,這無形中也就增加了實驗成本,因此,尋找一種高效、經濟的總RNA提取方法顯得尤為必要。
組織RNA提取的操作步驟:
1)液氮研磨,組織塊直接放入研缽中,加入少量液氮,迅速研磨,待組織變軟(僅可軟一次),乘它是軟的,把它壓平,繼續研磨。若液氮揮發完要迅速補充液氮,一直讓樣品保持凍著的狀態。磨到差不多的時候,聚組織于一堆,加Trizol在它們上面。錫箔紙蓋住研缽室溫靜置10Min左右,至混合液溶解。
注意:不要等組織變軟,變軟后RNA容易降解。但是軟一次,實驗證明沒。
事的,壓平后很容易磨碎。其實凍著狀態更容易磨碎。磨的時候,小心組織飛掉。飛掉的話,我們是撿回來的。研磨這步很重要,研磨既要充分又不能讓RNA降解,磨到粉末狀。
2)吸入混合液于無酶的1.5mlEp管中,再加氯仿,用手劇烈震蕩30s,室溫放置15Min。
注意:加氯仿使RNA進入離心后的上層液體中。
3)4℃12000g離心15Min。
4)取上清于另一個EP管中,再加200ul氯仿,吹打混勻,同樣條件再離心一次。
5)吸上清于另一個EP管中。
注意:不可全吸,防止吸入下面的雜質。
6)加入等體積的異丙醇,室溫放置5—10Min。
7)4℃12000g離心10Min棄上清8)加入1ml75%乙醇,溫和震蕩得沉淀。
9)4℃8000g離心5Min盡量棄上清。
10)室溫干燥5---10Min(倒扣于濾紙上,EP管蓋子打開)。
11)10ul的DEPC水溶解,吹打混勻。
12)19ulDEPC水于另一支EP管中,從中取1ul于其中吹打混勻測OD值。