基因組DNA提取實驗原理:基因表達的半定量PCR檢測,真核細胞含有三類基本RNA:核糖體RNA、信使RNA、轉移RNA。其中mRNA傳遞合成蛋白質的全部遺傳信息,是蛋白質生物合成的中間環節,具有特殊意義。Trizol試劑可從細胞中快速提取細胞總RNA,將其中的mRNA逆轉錄成cDNA,以一對特異性引物對目的cDNA進行聚合酶鏈式反應擴增。
基因組DNA提取的實驗流程:
1、研缽以液氮預冷,將適量玉米幼苗新鮮葉片置于研缽中,倒入液氮,迅速研磨至粉末級,研磨期間加入液氮,防止研磨過程中DNA被內源DNA酶降解;
2、將研磨好的粉末移入滅菌后的50mL抽提試管中,用移液管加入10mL月桂酸鈉抽提緩沖液,反復緩慢的搖勻;
3、向上述抽提管中加入3ulRNA酶,37℃放置30分鐘;
4、用移液管向50mL抽提試管中加入等體積酚:異戊醇,反復緩慢的搖勻;
5、室溫離心15min后取出,小心吸取上清液9mL于新滅菌的50ml抽提試管中;
6、向上述抽提試管中加入0.7倍體積異丙醇,上下緩慢顛倒數次,有白色絮狀沉淀析出,顛倒時注意往一個方向,防止沉淀散開,不利于后續實驗;
7、將白色絮狀沉淀用槍頭從抽提試管中輕輕挑出,至于1.5mLEP管中;
8、向上述1.5mLEP管中加入1mL75%乙醇,反復輕輕震蕩洗滌,室溫,高速離心5min,棄上清,重復此步驟兩次;
9、將得到的白色沉淀再次室溫,短暫離心數秒,取出后,用移液器吸干殘留乙醇;
10、白色沉淀置于37°C干燥箱中,使殘存的75%乙醇全部揮發干凈,這個過程中要經常拿出觀察,防止過度烘干,不利于后面溶解;
11、待白色沉淀變透明后,向1.5mLEP管中加入0.4mLTE緩沖液,放置于65℃恒溫箱中,期間輕微彈勻,使DNA充分溶解;
12、DNA完全溶解后,以1%瓊脂糖膠檢測是否有RNA殘留,檢測合格后,分裝,保存于冰箱中。